Диагностика патогенных возбудителей микробиоты влагалища методом количественной ПЦР в реальном времени

Введение

Инфекции, передаваемые половым путем, являются важной социальной проблемой, ассоциированной с ухудшением репродуктивного потенциала популяции, снижением качества жизни, а также со значительной нагрузкой на бюджет здравоохранения.

По данным ВОЗ, за 2012 г. зарегистрировано 357 млн новых случаев ИППП, подавляющее большинство которых приходится на возбудителей гонореи (Neisseria gonorrhoeae), хламидиоза (Chlamydia trachomatis) и трихомониаза (Trichomonas vaginalis) [1]. Часто ИППП протекают бессимптомно, и нераспознанная инфекция может привести к таким осложнениям как бесплодие, мертворождение, врожденные инфекции у новорожденного [2]. Кроме того, наличие ИППП повышает риск инфицирования ВИЧ [3].

Молекулярно-биологические исследования, основанные на методе амплификации НК (полимеразной цепной реакции, ПЦР), рекомендованы для диагностики ИППП [4] и обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными культуральными и микроскопическими методами. ПЦР тестирование позволяет получить результат за достаточно короткое время, обладает высокой специфичностью и чувствительностью, что важно для выявления хронической инфекции, когда патоген персистирует в низкой концентрации [5]. Кроме того, метод позволяет проводить исследование в количественном формате, что имеет значение для мониторинга эффективности лечения [6].

Целью работы была разработка и валидация набора реагентов для качественного и количественного определения ДНК Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium и Trichomonas vaginalis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени».

Материалы и методы

Клинические испытания набора были проведены с использованием биологического материала – соскобного материала и отделяемого слизистых оболочек урогенитального тракта, как наиболее часто тестируемого материала для выявления ИППП. Всего было исследовано 500 образцов, в том числе: 185 образцов мазков со слизистой оболочки влагалища, 155 образцов соскоба эпителия цервикального канала и 160 образцов соскоба эпителия уретры) женщин с диагнозом вагинит, цервицит или уретрит. Медиана возраста составила 31 год (от 16 до 42 лет). Материал был получен после проведения значимых исследований.

Предел обнаружения, линейный диапазон, воспроизводимость и повторяемость определяли с использованием модельных образцов, представляющих собой разведение стандартных образцов предприятия (СОП), содержащих фрагмент ДНК возбудителя в известной концентрации, в клиническом материале, не содержащем ДНК выявляемых патогенов. Для определения предела детекции тестировали 10-кратные разведения СОП в концентрации от 10 до 1000 ГЭ/мл в 6 повторах. Линейный диапазон определяли путем пятикратного тестирования разведений СОП в пределах от границы обнаружения до 1×108 ГЭ/мл. Воспроизводимость и повторяемость количественных результатов определяли путем тестирования 80 модельных образцов, в трех концентрациях (от 5×103 до 1×104 ГЭ/мл, 5×104 до 1×105 ГЭ/мл и более 5×105 ГЭ/мл).

Аналитическую специфичность набора определяли тестированием ДНК и геномной ДНК человека. ДНК микроорганизмов в концентрации не менее 1х106 ГЭ/мл и геномную ДНК человека в концентрации 1 мкг/мл вносили в образцы биологического материала, не содержащие определяемые с помощью набора микроорганизмы. В исследование были включены следующие микроорганизмы: Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, Herpes simplex virus type 1, Herpes simplex virus type 2, Human papilloma virus 16, Cytomegalovirus, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Escherichia coli, Candida albicans, Enterococcus faecium, Neisseria flava, Neisseria subflava, Neisseria sicca, Neisseria mucosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Lactobacillus casei, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum.

Экстракция ДНК из 100 мкл клинического материала проводилась с использованием набора реагентов «МагноПрайм ФАСТ» (НекстБио, Россия), согласно инструкции по применению набора.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием ПО Excel (пакет MS Office).

В качестве набора сравнения использован набор реагентов «АмплиПрайм NCMT» (РУ№ФСР 2015/31.

Результаты

На основании проведенного probit-анализа, предел обнаружения выявляемых патогенов составил: N. gonorrhoeae – 5,0×102 ГЭ/мл (95% ДИ 3,1×102–8,8×102 ГЭ/мл), C. trachomatis – 5,0 102 ГЭ/мл (95% ДИ 2,9×102 –7,9×102 ГЭ/мл), M. genitalium – 1,0×103 ГЭ/мл 95%ДИ 7,0×102 –1,7×103 ГЭ/мл), T. vaginalis – 50 ГЭ/мл (95% ДИ 3,6×101–7,6×101 ГЭ/мл).

Линейный диапазон составил: для N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium – 2×103–1×107 ГЭ/мл, для T. vaginalis – 2×102–1×107 ГЭ/мл.

Коэффициент вариации при исследовании повторяемости измерения на основании тестирования 40 модельных образцов в трех концентрациях в одних условиях (в один день, одним лаборантом) составил:

• В диапазоне концентраций от 5×103 до 1×104ГЭ/мл: 1,5% (N. gonorrhoeae), 2,0% (C. trachomatis), 2,5% (M. genitalium) и 1,1% (T. vaginalis).
• В диапазоне концентраций от 5×104 до 1×105 ГЭ/мл: 1,9% (N. gonorrhoeae), 1,8% (C. trachomatis), 1,9% (M. genitalium) и 0,8% (T. vaginalis).
• В диапазоне концентраций более 5×105 ГЭ/мл: 1,2% (N. gonorrhoeae), 1,4% (C. trachomatis), 1,5% (M. genitalium) и 1,1% (T. vaginalis).

Воспроизводимость определяли путем тестирования 80 модельных образцов в трех концентрациях в разных условиях (в разные дни, разными лаборантами):

• В диапазоне концентраций от 5×103 до 1×104 ГЭ/мл коэффициент вариации (CV): 1,9% (N. gonorrhoeae), 2,1% (C. trachomatis), 2,6% (M. genitalium) и 1,3% (T. vaginalis).
• В диапазоне концентраций от 5×104 до 1×105 ГЭ/мл коэффициент вариации (CV): 2,0% (N. gonorrhoeae), 1,9% (C. trachomatis), 1,9% (M. genitalium) и 1,0% (T. vaginalis).
• В диапазоне концентраций более 5×105 ГЭ/мл коэффициент вариации (CV): 1,2% (N. gonorrhoeae), 1,5% (C. trachomatis), 1,5% (M. genitalium) и 1,2% (T. vaginalis).

При исследовании аналитической специфичности перекрестных реакций не выявлено.

Для исследования специфичности и чувствительности нового набора было исследовано 500 образцов биологического материала, одновременно с референсным набором «АмплиПрайм NCMT». Все полученные результаты были признаны валидными на основании амплификации внутреннего контроля образца в исследуемом и референсном тестах.

При качественном исследовании с использованием контрольного набора «АмплиПрайм NCM(T)» образцов соскобного материала или отделяемого слизистых оболочек урогенитального тракта обнаружено 104 положительных образца, содержащих ДНК N. gonorrhoeae; 102 положительных образца, содержащих ДНК C. trachomatis; 108 положительных образцов, содержащих ДНК M. genitalium и 101 положительный образец, содержащих ДНК T. vaginalis.

Исследование с использованием референсного набора оказало полное совпадение положительных и отрицательных результатов. На основании полученных данных была рассчитана диагностическая чувствительность и специфичность с учетом 95% доверительной вероятности. Результаты представлены в таблице.

Сравнение количественного определения ДНК патогенов в биологическом материале с использованием тестируемого («АмплиПрайм NCM(T)») и референсного наборов («АмплиПрайм NCMT») проводили с использованием корреляционного анализа Бленда–Альтмана. Полученные графические данные представлены на рисунке.

По оси ординат представлена разница количественных результатов, полученных с использованием тестируемого набора АмплиПрайм NCM(T) и референсного набора АмплиПрайм NCMT (СNCM(T) – CNCMT), по оси абсцисс – среднее значение полученных результатов ((СNCM(T) + CNCMT)/2). Черная прерывистая линия – границы 95% доверительного интервала (1,96 × стандартное отклонение), серая линия – среднее значение разницы между количественными результатами, ее расположение рядом с нулевой осью ординат свидетельствует о совпадении результатов обоих тестов.

Обсуждение

Выявление ИППП с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот является важным этапом диагностики венерических заболеваний. ПЦР тесты позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять одновременно несколько патогенов в одном образце. До 10% пациентов с ИППП могут иметь микстинфекцию, среди которых наиболее распространенной комбинацией является коинфекция C.trachomatis и M. genitalium [7]. Поэтому использование тестов для одновременного определения наиболее распространенных возбудителей ИППП позволяет значительно повысить эффективность скрининга и снизить нагрузку на лабораторию.

Набор реагентов «АмплиПрайм NCM(T)» предназначен для качественного и количественного определения ДНК N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium и T. vaginalis в биологическом материале (соскобный материал или отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта (влагалища, цервикального канала, уретры), прямой кишки, ротоглотки, конъюнктивы; моча; секрет предстательной железы) методом полимеразной цепной реакции. Для количественного измерения концентрации ДНК возбудителей в клиническом материале исследование проводят одновременно с образцом с известной концентрацией и на основании существования линейной зависимости между концентрацией ДНК и граничным циклом Ct, происходит определение концентрации ДНК мишени в исследуемом материале. Кроме того, исследование каждого образца проводится с использованием внутреннего контрольного образца – искусственно синтезированной последовательности, которая проходит через все этапы анализа и позволяет контролировать качество прохождения исследования в каждом отдельном образце.

Целью исследования было валидировать набор реагентов «АмплиПрайм NCM(T)» относительно референсного набора «АмплиПрайм NCMT». Показано полное совпадение качественных и количественных результатов. Стандартное отклонение при сравнении количественных результатов двух тестов составило менее 0,3 lg ГЭ/мл, что является достаточным для количественного определения с использованием методов амплификации НК [8]. При этом стандартное отклонение при определении воспроизводимости и повторяемости не превышало 0,13 lgГЭ/мл.

Совпадение истинноположительных и истинноотрицательных результатов составило 100% для всех выявляемых патогенов. Тест показал высокую чувствительность и специфичность исследования.

Однако выявление возбудителей ИППП экстрагенитальной локализации [9] требует введения дополнительных видов биологического материала и расширенной валидации набора, с использованием соскобов эпителия прямой кишки, ротоглотки, конъюнктивы; мочи; секрета предстательной железы).

Заключение

В ходе валидации набор реагентов «АмплиПрайм NCM(T)» показал высокую чувствительность и специфичность по выявляемым патогенам, а также хорошую воспроизводимость количественных результатов как между разными сериями набора, так и в сравнении с результатами, полученными с использованием референсного набора «АмплиПрайм NCMT».

Литература

1. Report on sexually transmitted infections surveillance 2015. Geneva: World Health Organization; 2015. https://apps.who.int/iris/bitstream/ handle/10665/249553/9789241565301-eng.pdf, дата обращения 10.07.2019).
2. Hammerschlag M.R. Chlamydial and gonococcal infections in infants and children clinical infectious diseases. Clin Infect Dis. 2011; 53 (Suppl 3): S99–102. https:// doi.org/10.1093/cid/cir699
3. Reda S., Gonçalves F.A., Mazepa M.M., De Carvalho N.S. Women infected with HIV and the impact of associated sexually transmitted infections. Int J Gynaecol Obstet. 2018; 142 (2): 143–147. doi: 10.1002/ijgo.12507
4. 2015: Болезни кожи. Инфекции, передаваемые половым путем. 5-е изд., перераб. И доп. М.: Деловой экспресс, 2016. – 768 с. / Federal’nye klinicheskie rekomendacii. Dermatovenerologiya 2015: Bolezni kozhi. Infekcii, peredavaemye polovym putem. – 5-e izd., pererab. i dop. M.: Delovoj ekspress, 2016; 768 [In Russian]
5. Гомберг М.А., Гущин А.Е. Хламидийная инфекция в современной гинекологии: основные аспекты профилактики и лечения воспалительных заболеваний органов малого таза. Гинекология. – 2012. – Т. 14. – №4. С. 19–22. / Gomberg M.A., Gushchin A.E. Chlamydial infection in modern gynecology: the main aspects of prophylaxis and treatment of pelvic inflammatory diseases. Gynecology. 2015; 14 (4): 19–22. [In Russian]
6. Muralidhar S. Molecular methods in the laboratory diagnosis of sexually transmitted infections. Indian J Sex Transm Dis AIDS. 2015; 36 (1): 9–17. doi:10.4103/0253-7184.156686
7. Гущин А.Е., Рыжих П.Г., Савочкина Ю.А., Шипулина О.Ю., Шипулин Г.А. Изучение распространенности возбудителей ИППП (C. trachomatis, N. gonorrhoeae, М. genitalium, T. vaginalis) с помощью ПЦР в реальном времени в формате «МУЛЬТИПРАЙМ». Клиническая дерматология и венерология. – 2011. – № 4. – С. 90–93. / Gushchin A.E., Ryzhikh P.G., Savochkina Yu.A., Shipulina O.Yu., Shipulin G.A. Investigation the prevalence of the causative agents of STI (C. trachomatis, N. gonorrhoeae, М. genitalium, T. vaginalis) by real-time PCR using the MULTIPRIME system. Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology. 2011; 4: 90–93. [In Russian]
8. Karlen Y., McNair A., Perseguers S., Mazza C., Mermod N. Statistical significance of quantitative PCR. BMC Bioinformatics. 2007; 20; 8:131.
9. Chan P.A., Robinette A., Montgomery M., et al. Extragenital infections caused by Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. A review of the literature. Infect Dis Obstet Gynecol. 2016; 2016: 5758387. doi:10.1155/2016/5758387