Разработка набора для выявления ДНК вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Африканская чума свиней (АЧС) – контагиозная, склонная к природной очаговости, как правило, остро протекающая септическая болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и высокой летальностью. Течение заболевания может быть сверхострым, острым, подострым, хроническим и инаппарантным. Болеют домашние и дикие свиньи независимо от породы и возраста. Выжившие животные пожизненно остаются вирусоносителями [2].

Возбудителем заболевания является вирус АЧС – единственный член семейства рода Asfivirus в семействе Asfarviridae. Геном его представлен двухцепочечной ДНК размером 170 – 190 тысяч п.о. и содержит от 150 до 167 открытых рамок считывания, в зависимости от изолята. Вирус характеризуется высокой устойчивостью к факторам окружающей среды и способен быстро распространяться при прямом контакте больных и здоровых животных, контаминированными отходами, кормами, продуктами питания свиного происхождения, а также посредством биологических переносчиков – клещей рода Ornithodoros [9].

АЧС – одна из самых значимых болезней для мирового свиноводства. Это связано со способностью вируса к быстрому непредсказуемому распространению независимо от государственных границ, высоким уровнем летальности, огромным экономическим ущербом, складывающимся из затрат на проведение ветеринарно-санитарных и карантинных мероприятий, убоя всего поголовья свиней на территории очага болезни и ограничений в международной торговле [8].

Для своевременного принятия мер по ликвидации очага болезни, предотвращению ее распространения, а также для дифференциальной диагностики от других инфекций со схожими клиническими признаками, таких как классическая чума свиней (КЧС), репродуктивно-респираторный синдром (РРСС), синдром дерматита и нефропатии поросят, необходима быстрая, надежная, чувствительная и специфическая диагностика АЧС. Заключается она в обнаружении особей, которые в настоящее время или ранее были инфицированы вирусом АЧС. Методы лабораторной диагностики АЧС подразделяются на вирусологические (идентификация вируса), молекулярно-биологические (выявление геномной ДНК вируса) и серологические (выявление вирусного антигена или антител). Поскольку животные могут находиться на разных стадиях инфекционного процесса, необходимо применять методики, направленные как на выявление вируса, так и на обнаружение антител к нему. В первые дни после заражения в организме свиней репродуцируется большое количество вируса при отсутствии антител, поэтому для диагностики АЧС используют методы выявления генома и антигенов возбудителя. С 7 – 10 суток после инфицирования антитела начинают вырабатываться в достаточном количестве для детекции и тогда для диагностики целесообразно применять серологические методы. Рекомендованные МЭБ и ФАО диагностические методы включают: выделение вируса в пермиссивных культурах клеток, идентификацию его в реакции гемадсорбции (РГАд), обнаружение вирусного антигена и антител к нему в реакциях прямой и непрямой иммунофлюоресценции (РПИФ, РНИФ) и твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА), а также выявление вирусного генома с помощью классического варианта ПЦР и ПЦР в режиме реального времени [1, 5]. Перечисленные способы имеют свои достоинства и недостатки. Так, например, РПИФ и ИФА более дешёвые тесты, но менее чувствительные по сравнению с ПЦР [4, 10, 12]. РГАд при идентификации вируса АЧС – чувствительный тест, но требует несколько дней для получения данных и наличия первичных культур клеток свиного происхождения. При его использовании из-за циркуляции вирулентных негемадсорбирующих и нецитопатогенных штаммов вируса АЧС увеличивается вероятность получения ложноотрицательных результатов.

Метод ПЦР представляет собой чувствительную, специфичную и быструю альтернативу вирусовыделению. С его помощью геном возбудителя можно выявить даже в пробах, содержащих нежизнеспособный вирус (термически обработанных, подгнивших и т.д.), когда не удается выделить последний в культуре клеток. ПЦР дает возможность устанавливать диагноз на АЧС в течение нескольких часов после получения материала и своевременно принимать меры по ликвидации вспышки заболевания. Этот метод позволяет идентифицировать широкий спектр изолятов вируса АЧС, принадлежащих ко всем 22 известным генотипам, включая негемадсорбирующие и низковирулентные изоляты; выявлять геном вируса АЧС в трубчатых костях и мышцах, что особенно важно при исследовании трупов диких свиней (кабанов), которые нередко обнаруживают егеря и охотники [4, 7, 11, 13].

Экспериментально доказано, что геном вируса АЧС способен длительное время сохраняться в продуктах питания, изготовленных из мяса инфицированных свиней, поэтому при исследовании методом ПЦР образцов пищевой продукции можно проследить пути распространения вируса АЧС и оценить качество проводимых противоэпизоотических мероприятий [3].

Все вышеперечисленное обусловливает актуальность данных исследований, цель которых – разработка набора реагентов для выявления генома вируса АЧС методом ПЦР в режиме реального времени.

Материалы и методы. При создании и валидации набора реагентов для выявления ДНК вируса АЧС использовали пробы селезенки от естественно инфицированных вирусом АЧС свиней и образцы заведомо положительного материала пищевой продукции. Аналитическую специфичность данного набора оценивали с помощью проб биологического материала от свиней, естественно инфицированных вирусами классической чумы свиней, репродуктивно-респираторного синдрома свиней, цирковирусами свиней 2 и 3 типов, культурального материала, содержащего вирус болезни Ауески из рабочей коллекции микроорганизмов ФГБУ ЦНМВЛ (г. Москва) и антигена парвовируса свиней из набора препаратов для серодиагностики парвовирусной инфекции свиней в реакции торможения гемагглютинации (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Анализ нуклеотидных последовательностей генов вируса АЧС, изолятов и штаммов депонированных в базе данных генетической информации GenBank, а также расчет первичных структур олигонуклеотидных праймеров и зондов для ПЦР в режиме реального времени проводили с помощью программ BioEdit 7.0 и Oligo 6.0.

ДНК вируса АЧС выделяли, используя набор реагентов для выделения ДНК/РНК «МагноПрайм ВЕТ» (ООО «НекстБио», г. Москва). Амплификацию выполняли на детектирующих термоциклерах «Rotor-Gene Q» («Qiaqen», Германия), «CFX96» («Bio-Rad», США), «QuantStudio 5» («Thermo Fisher Scientific», США) и «ДТ Прайм» (ООО «ДНК-Технологии», Россия). Температурно-временной режим амплификации был следующим: 15 мин предварительной денатурации при 95 0С и 45 циклов амплификации: 95 0С – 10 с; 60 0С – 20 с. Флуоресценцию измеряли по каналам для флуорофоров FAM (амплификация генома вируса АЧС) и R6G (амплификация внутреннего контрольного образца – ВКО) при температуре 60 0С. Результаты интерпретировали по наличию/отсутствию пересечения кривой флуоресценции с автоматически установленной прибором пороговой линией (Threshold).

Результаты исследований и обсуждение. На основе анализа доступных в базе данных GenBank последовательностей генов штаммов и изолятов вируса АЧС выбрали высококонсервативный участок внутри нуклеотидной последовательности гена p72. При помощи программы Oligo 6.0 определили последовательности праймеров для амплификации участка данного гена размером 86 пар оснований. Для детекции продуктов амплификации рассчитали нуклеотидную последовательность линейного гибридизационного разрушаемого зонда (Taq-man), содержащего на 5’-конце флуоресцентный краситель FAM, а на 3'-конце – гаситель флуоресценции BHQ-1.

При этом применяли стандартный для всех наборов серии «АмплиПрайм» формат исполнения: олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентномеченый зонд и смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов входили в состав ПЦР-смеси АЧС (в количестве 10 мкл на одну пробу), а ПЦР-буфер и Taq-ДНК-полимераза – в состав ПЦР-буфера В (в количестве 5 мкл на одну пробу).

Аналитическую чувствительность выявления генома вируса АЧС определяли, исследуя последовательные десятикратные разведения рекомбинантной плазмиды, содержащей фрагмент гена p72, с исходной концентрацией 1х108 копий ДНК/мл. Согласно представленным на рисунке 1 и в таблице 1 данным, минимальная концентрация плазмидной ДНК, для которой получен положительный результат, составила 1х103 копий ДНК/мл. Внутритестовая повторяемость полученных данных, выраженная в средних стандартных отклонениях, находится в диапазоне от 0,05 до 0,36, а коэффициенты вариации значений Ct не превышают 1,05 %.

Рис. 1. Аналитическая чувствительность выявления генома вируса АЧС с помощью разработанного набора, цифрами обозначены концентрации рекомбинантной плазмидной ДНК (копий ДНК/мл): 1 – 107; 2 – 106; 3 – 105; 4 – 104; 5 – 103.

Таблица 1

Чувствительность выявления генома вируса АЧС, n=3

Аналитическую специфичность устанавливали исследованием: проб селезенки от естественно инфицированных вирусом АЧС свиней; биоматериала, взятого от клинически здоровых животных (кровь, сыворотка крови, мазки со слизистых оболочек ротовой и носовой полости свиней); образцов, содержащих вирусы классической чумы свиней, репродуктивно-респираторного синдрома свиней, цирковирусов свиней 2 и 3 типов, болезни Ауески и антигена парвовируса свиней. При тестировании всех перечисленных образцов положительные результаты получили только с пробами селезенки от естественно инфицированных вирусом АЧС животных, что свидетельствует о специфичности разработанного набора.

С помощью проб селезенки от естественно инфицированных вирусом АЧС свиней контролировали повторяемость и внутрилабораторную воспроизводимость результатов. При определении повторяемости пробы селезенки тестировал один оператор на одном оборудовании (амплификатор «Rotor-Gene Q») в трех повторах. Согласно таблице 2, данный показатель был высоким, а коэффициент вариации, составивший 1,2 – 1,7 %, свидетельствует о низкой его изменчивости в условиях повторяемости.

Таблица 2

Повторяемость результатов исследования проб биологического материала с использованием набора «АмплиПрайм® АЧС»

При тестировании внутрилабораторной воспроизводимости два оператора исследовали пробы селезенки в трех повторах в разные дни на разном оборудовании (амплификаторы «Rotor-Gene Q» и «CFX96»). Представленные в таблице 3 коэффициенты вариации значений Ct, находящиеся в диапазоне 3,6 – 6,6 %, свидетельствуют о высокой воспроизводимости результатов ПЦР.

Таблица 3

Воспроизводимость результатов исследования проб биологического материала с помощью набора «АмплиПрайм® АЧС»

Пригодность разработанного набора реагентов для выявления генома вируса АЧС в пробах пищевой продукции оценивали, исследуя сырое мясо, полуфабрикаты и колбасные изделия. ДНК вируса АЧС установили во всех образцах (табл. 4).

Таблица 4

Результаты выявления генома вируса АЧС в образцах пищевой продукции

Заключение. Нами разработан набор реагентов для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в режиме реального времени «АмплиПрайм® АЧС», обладающий аналитической чувствительностью 1х103 копий ДНК/мл. Он позволяет специфически выявлять ДНК вируса АЧС при исследовании различных образцов биоматериала (кровь, смывы со слизистых оболочек ротовой и носовой полостей, пробы органов), а также образцов пищевой продукции.

Литература

1. Алькрудо Д.Б., Ариас М., Гайардо К. и др. Африканская чума свиней: обнаружение и диагностика. Руководство для ветеринаров. Рим: ФАО, 2017; 104.
2. Газаев И.Х. Совершенствование методов индикации генома вируса африканской чумы свиней в объектах ветеринарного надзора: Дис. ... канд. биол. наук. Покров, 2011; 134 с.
3. Синдрякова И.П. Инфекционная активность вируса африканской чумы свиней в лабораторных образцах и пищевых продуктах при разных температурных режимах (с экстраполяцией на сохраняемость в природных условиях). Сельскохозяйственная биология. 2016; 51(4):467 – 474.
4. Шевченко А.А., Черных О. Ю., Джаилиди Г.А. и др. Учебное пособие «Диагностика африканской чумы свиней». Краснодар: КубГАУ, 2013; 29.
5. African swine fever (infection with African swine fever virus) [Электронный ресурс]. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals 2019, OIE. https://www.oie.int/standard-setting/terrestrial-manual/access-online
6. African swine fever. EFSA Journal. 2015; 13(7): 4163.
7. Boshoff C.I., Bastos A.D., Gerber L.J., Vosloo W. Genetic characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa (1973 – 1999). Veterinary Microbiology. 2007; 121:45 – 55.
8. Chenais E, Boqvist S., Emanuelson U. et al. Quantitative assessment of social and economic impact of African swine fever outbreaks in northern Uganda. Prev. Vet. Med. 2017; 144:134 – 148.
9. Gaudreault N.N., Madden D.W., Wilson W.C. et al. African Swine Fever Virus: An Emerging DNA Arbovirus. Front. Vet. Sci. 2020; 7:215.
10. Gonzague M., Roger F., Bastos A. et al. Isolation of a non-haemadsorbing, non-cytopathic strain of African swine fever virus in Madagascar. Epidemiology and Infection. 2001; 126:453 – 459.
11. Michaud V., Gil P., Kwiatek O. et al. Long-term storage at tropical temperature of dried-blood filter papers for detection and genotyping of RNA and DNA viruses by direct PCR. Journal of Virological Methods. 2007; 146:257 – 265.
12. Oura C.A.L., Edwards L., Batten C.A. Virological diagnosis of African swine fever - comparative study of available tests. Virus Research. 2013; 173:150 – 158
13. Steiger Y., Ackermann, M., Mettraux C., Kihm U. Rapid and biologically safe diagnosis of African swine fever virus infection by using polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 1992; 30:1 – 8.